Microscopie crioelectronică

De la Wikipedia, enciclopedia liberă
Salt la: Navigare, căutare
Imagine de microscopie crioelectronică a GroEl suspendată în gheață amorfă la o mărire de 50000x

Microscopia crioelectronică (crio-ME), sau criomicroscopia electronică, este o formă de microscopie electronică de transmisie (MET) în care proba este studiată la temperaturi criogenice (în general temperatura azotului lichid). Crio-ME a câștigat popularitate în biologia structurală.[1]

Avantajul microscopiei crioelectronice provine din faptul că permite observarea unor probe care nu au fost colorate sau fixate în vreun fel, arătându-le în mediul lor nativ. Acest lucru este în contrast cu cristalografia cu raze X, care necesită cristalizarea probelor, care poate fi dificilă, și plasându-le în  medii nefiziologice, poate conduce ocazional la modificări conformaționale funcționale irelevante.

Rezoluția hărților de de crio-ME s-a îmbunătățit în mod constant, și în 2014 au fost obținute unele structuri la o rezoluție aproape atomică, incluzând cele de virusuri, ribozomi, mitocondrii, canale ionice, și complexe enzimatice la fel de mici ca 170 kDa , la o rezoluție de 4.5 Å.[2] Bridget Carragher și colegii de la Resursa națională Scripps pentru microscopie moleculară automatizată au utilizat tehnici pe care ea și Clint Potter le-au dezvoltat pentru a crea prima imagine din biologia structurală de microscopie crioelectronică cu o rezoluție mai mică de 3 Ångströmi, ridicând astfel crio-ME la un instrument comparabil și cu un potențial superior tehnicilor de cristalografie tradițională cu raze X.[3][4] O hartă de 2.2 Å a beta-galactozidazei, o enzimă bacteriană,  a fost publicată în iunie 2015.[5] O versiune a microscopiei crioelectronice este tomografia crioelectronică (TCE), în cazul căreia o reconstrucție 3D a unui eșantion este creată din  imagini 2D înclinate.

Dezvoltarea[modificare | modificare sursă]

Justificarea originală a microscopiei crioelectronice a fost crearea unui mijloc de luptă împotriva distrugerilor datorate radiațiilor pentru probele biologice. Cantitatea de radiație necesară pentru a obține o imagine dintr-o probă în microscopia electronică este suficient de mare pentru a fi o sursă potențială de daune pentru structurile delicate ale  probei. În plus, vidul înalt necesar pe coloana  microscopului electronic face ca  mediul să fie destul de dur pentru probă.

Problema vacuumului a fost parțial rezolvată prin introducerea colorării negative, dar chiar și cu colorare negativă probele biologice sunt predispuse la colaps structural prin deshidratare. Încorporarea probei în gheață sub temperatura de sublimare a fost o posibilitate avută în vedere de timpuriu, dar apa tinde să se aranjeze la congelare într-o rețea cristalină cu densitate mai mică  și acest lucru poate distruge structura a orice este încorporat în ea.

La începutul anilor '80, mai multe grupuri care studiau fizica stării solide au încercat să producă gheață vitroasă prin diferite procedee, cum ar fi înghețarea la presiune înaltă sau înghețarea rapidă. Într-o lucrare semnificativă din 1984, grupul condus de Jacques Dubochet de la Laboratorul european de biologie moleculară a arătat imagini ale unui adenovirus încorporat într-un strat vitrificat de apă.[6] Această lucrare este în general considerată ca marcând originea microscopiei crioelectronice, iar tehnica a fost dezvoltată atât de mult, încât a devenit rutină în numeroase laboratoare din întreaga lume.

Energia electronilor utilizați pentru imagistică (80-300 kV) este suficient de mare încât legăturile covalente pot fi rupte. Când se obțin imagini de la probe vulnerabile la radiații, este necesar să se limiteze expunerea la electronii utilizați pentru achiziționarea imaginii. Aceste expuneri reduse, necesită ca imaginile a mii sau chiar milioane de molecule identice, congelate,  să fie selectate, aliniate și realizată o medie, pentru a obține hărți de înaltă rezoluție, folosind software specializat. O îmbunătățire semnificativă a caracteristicilor structurale a fost obținută în 2012 prin introducerea detectoarelor directe de electroni și a unor algoritmi computaționali mai buni.

În 2017, Premiul Nobel pentru Chimie a fost acordat în comun lui Jacques Dubochet, Joachim Frank și Richard Henderson, "pentru dezvoltarea criomicroscopiei electronice cu scopul determinării cu înaltă rezoluție a structurii biomoleculelor din soluții".[7]

Probele biologice[modificare | modificare sursă]

Film subțire[modificare | modificare sursă]

Materialul biologic este depus pe o grilă de microscopie electronică și este păstrat într-o stare de îngheț hidratat prin congelare rapidă, de obicei în etan lichid la o temperatură apropiată de cea a azotului lichid. Prin menținerea probelor la temperatura azotului lichid sau mai scăzută, acestea pot fi introduse în coloana de vacuum înalt a microscopului electronic. Cele mai multe probe  biologice sunt extrem de radiosensibile, astfel încât acestea trebuie să fie vizualizate cu tehnici de doze mici (util, temperatura scăzută a criomicroscopiei electronice oferă un  factor suplimentar de protecție împotriva daunelor produse prin radiații).

În consecință, imaginile au un zgomot de fond foarte mare. Pentru unele sisteme biologice este posibilă obținerea unei medii a imaginilor cu scopul creșterii raportului semnal-zgomot și obținerii de informații de înaltă rezoluție  despre probă, folosind tehnica cunoscută ca analiza unei singure particule. Această abordare, în general, necesită ca particulele a căror medie se calculează să fie identice, deși acum pot fi studiate și entități cu heterogenitate conformațională limitată (de exemplu, ribozomi). Reconstituirile tridimensionale din imaginile de crio-ME  ale complexelor proteice și a virusurilor au fost obținute la rezoluție subnanometrică sau aproape atomică, permițând noi perspective în structura și biologia acestor mari ansambluri.

Analiza agregatelor ordonate de proteine, cum ar fi cristalele 2-D ale proteinelor transmembranare sau a agregatelor elicoidale de proteine, permite de asemenea un fel de medie, care poate oferi informații de înaltă rezoluție  despre specimene. Această tehnică se numește cristalografia electronică.

Secțiunea vitrificată[modificare | modificare sursă]

Metoda filmului subțire este limitată la eșantioane subțiri (de obicei <500 nm), deoarece electronii nu pot traversa eșantioane mai groase fără evenimente multiple de împrăștiere. Eșantioanele mai groase pot fi vitrificate prin înghețare prin plonjare (criofixare) în etan (până la zeci de  μm grosime) sau mai frecvent prin congelare la presiune ridicată (până la sute de μm). Acestea pot fi apoi tăiate în secțiuni subțiri (cu grosimea de 40 până la 200 nm) cu un cuțit diamantat într-un crioultramicrotom la temperaturi mai mici de -135 ° C (temperatura de devitrificare). Secțiunile sunt colectate pe o rețea de microscopie electronică și sunt vizualizate în același mod ca și specimenul vitrificat în peliculă subțire. Această tehnică se numește microscopie crioelectronică a secțiunilor vitrificate (MCESV) sau microscopie crioelectronică a secțiunilor hidratate înghețate.

Specimene materiale[modificare | modificare sursă]

Pe lângă faptul că este posibilă vizualizarea probelor biologice vitrificate, crio-ME poate fi de asemenea utilizată pentru a vizualiza specimene de material care sunt prea volatile în vid pentru a fi vizualizate folosind microscopia electronică standard la  temperatura camerei. De exemplu, secțiunile vitrificate ale interfețelor lichid-solid pot fi extrase pentru analiză prin crio-ME,[8] iar sulful, care este predispus la sublimare în vidul microscoapelor electronice, poate fi stabilizat și vizualizat în crio-ME.[9]

Tehnici[modificare | modificare sursă]

O varietate de tehnici pot fi utilizate în microscopia crioelectronică.[10] Tehnici populare includ:

  1. Cristalografia electronică
    1. Analiza cristalelor bidimensionale
    2. Analiza filamentelor sau tuburilor elicoidale
  2. Analiza unei singure particule
  3. Criotomografia electronică
  4. MicroED (Difracție electronică pe microcristale)
  5. Crio-ME cu rezoluție temporală[11][12][13]

Referințe[modificare | modificare sursă]

  1. ^ Callaway, Ewen (2015). „Revoluția nu va fi cristalizată: o nouă metodă străbate biologia structurală”. Nature 525 (7568): 172–4. doi:10.1038/525172a. PMID 26354465. Bibcode2015Natur.525..172C. 
  2. ^ Kuehlbrandt, Werner (2014). „Microscopia crioelectronică intră într-o nouă eră”. eLife 3: e03678. doi:10.7554/elife.03678. PMID 25122623. 
  3. ^ Dellisanti, Cosma (2015). „Rezoluție care sparge bariera”. Nature Structural & Molecular Biology 22 (5): 361. doi:10.1038/nsmb.3025. 
  4. ^ Campbell, Melody G; Veesler, David; Cheng, Anchi; Potter, Clinton S; Carragher, Bridget (2015). „Reconstrucția cu o rezoluție de 2,8 Å a proteosomului 20S a Thermoplasma acidophilum utilizând microscopia crioelectronică”. eLife 4. doi:10.7554/eLife.06380. PMID 25760083. 
  5. ^ Bartesaghi, A.; Merk, A.; Banerjee, S.; Matthies, D.; Wu, X.; Milne, J. L. S.; Subramaniam, S. (2015). „Structura complexului galactozidazei cu un inhibitor de permeabilitate celulară la o rezoluție de 2.2 în microscopie crioelectronică”. Science 348 (6239): 1147–51. doi:10.1126/science.aab1576. PMID 25953817. Bibcode2015Sci...348.1147B. 
  6. ^ Adrian, Marc; Dubochet, Jacques; Lepault, Jean; McDowall, Alasdair W. (1984). „Microscopia crioelectronică a virusurilor”. Nature 308 (5954): 32–6. doi:10.1038/308032a0. PMID 6322001. Bibcode1984Natur.308...32A. 
  7. ^ Premiul Nobel pentru Chimie din 2017 - Comunicat de presă”. 4 octombrie 2017. https://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2017/press.html. Accesat la 4 Octombrie 2017. 
  8. ^ Zachman, Michael J.; Asenath-Smith, Emily; Estroff, Lara A.; Kourkoutis, Lena F. (2016). „Pregătirea specifică a site-ului pentru interfețe intacte lichid solid prin localizare in situ cu etichetare liberă și criofolcalizarea și ridicarea fasciculului de ioni”. Microscopy and Microanalysis 22 (6): 1338–1349. doi:10.1017/S1431927616011892. PMID 27869059. Bibcode2016MiMic..22.1338Z. 
  9. ^ Levin, Barnaby D.A.; Zachman, Michael J.; Werner, Jörg G.; Sahore, Ritu; Nguyen, Kayla X.; Han, Yimo; Xie, Baoquan; Ma, Lin et al. (2017). „Caracterizarea catodurilor de sulf și nanostructurate de baterii de sulf în microscopia electronică fără artefacte de sublimare”. Microscopy and Microanalysis 23 (1): 155–162. doi:10.1017/S1431927617000058. PMID 28228169. Bibcode2017MiMic..23..155L. 
  10. ^ Prezentare despre microscopia crioelectronică | PharmaXChange.info
  11. ^ Fu, Ziao; Kaledhonkar, Sandip; Borg, Anneli; Sun, Ming; Chen, Bo; Grassucci, Robert A.; Ehrenberg, Måns; Frank, Joachim (2016). „Intermediari-cheie în reciclarea ribozomului vizualizați prin microscopia crioelectronică cu rezolvare în timp”. Structure 24 (12): 2092–2101. doi:10.1016/j.str.2016.09.014. PMID 27818103. 
  12. ^ Feng, Xiangsong; Fu, Ziao; Kaledhonkar, Sandip; Jia, Yuan; Shah, Binita; Jin, Amy; Liu, Zheng; Sun, Ming et al. (2017). „O metodă rapidă și eficientă de pulverizare-plonjare microfluidă pentru microscopia crioelectronică cu o singură particulă de înaltă rezoluție”. Structure 25 (4): 663–670.e3. doi:10.1016/j.str.2017.02.005. PMID 28286002. 
  13. ^ Chen, Bo; Kaledhonkar, Sandip; Sun, Ming; Shen, Bingxin; Lu, Zonghuan; Barnard, David; Lu, Toh-Ming; Gonzalez, Ruben L. et al. (2015). „Dinamica structurală a asocierii subunitaților ribosomului, studiată prin microscopie criogenă electronică cu mixare-pulverizare cu rezolvare în timp”. Structure 23 (6): 1097–105. doi:10.1016/j.str.2015.04.007. PMID 26004440. 

Lectură suplimentară[modificare | modificare sursă]

  • Frank, Joachim (2006). Microscopia electronică în trei dimensiuni a ansamblurilor de macromolecule. New York: Oxford University Press. ISBN 0-19-518218-9 
  • Van Heel, Marin; Gowen, Brent; Matadeen, Rishi; Orlova, Elena V.; Finn, Robert; Pape, Tillmann; Cohen, Dana; Stark, Holger et al. (2000). „Criomicroscopia electronică a unei singure particule: spre rezoluția atomică”. Quarterly Reviews of Biophysics 33 (4): 307–69. doi:10.1017/s0033583500003644. PMID 11233408. 

Link-uri externe[modificare | modificare sursă]

Baze de date primare: