HPLC

De la Wikipedia, enciclopedia liberă
Salt la: Navigare, căutare
Fotografie a unui aparat HPLC. De la stânga la dreapta: Pompa de gradient, ce asigură fluxul de solvent, coloana cromatografică, aparat de înregistrare a absorbanţei

HPLC este prescurtarea de la High Performance Liquid Chromatography (Cromatografie lichidă de înaltă performanță), metodă de analiză calitativă utilizată în biochimie și chimie analitică pentru separarea, identificarea și cuantificarea compușilor. HPLC folosește o coloană încărcată cu diferite materiale (faza staționară), o pompă ce împinge faza(ele) mobilă(e) prin coloana și un detector care arată timpurile de retenție ale moleculelor. Timpul de retenție depinde de interacțiunea dintre faza staționară, moleculele de analizat și solvenții utilizați.

Analiza

Proba de analizat este introdusă în volum mic în fluxul fazei mobile. Trecerea analitului prin coloană este încetinită de prezența unor interacții de natură chimică sau fizică in faza staționară, acestea trecând de a lungul coloanei. Totalul încetinirilor depinde de fiecare analit în parte, faza staționară și compoziția fazei mobile. Timpul la care un analit specific eluează (iese afară din coloană) este numit timp de retenție; timpul de retenție sub condiții particulare este considerat o caracteristică unică de identificare a analitului dat. Folosirea unei coloane încărcată cu particule mici (care creează o presiune de împingere mai mare) crește viteza lineară, acordând compușilor timpul minim să difuzeze prin coloană, conducând astfel la o îmbunătățire a rezoluției cromatogramei rezultate. Solvenții comuni care se utilizează includ orice combinație miscibilă cu apa sau lichide organice variate (de obicei metanol sau acetonitril). Apa poate conține soluții tampon sau săruri care ajută la separarea componenților de analizat sau componenți ca acid trifloroacetic care acționează ca agent de împerechere ionică.

O rafinare mai bună a metodei HPLC a dus la posibilitatea de a varia compoziția fazei mobile în timpul analizei; aceasta este cunoscută sub denumirea de gradient de eluție. Un gradient normal pentru o fază cromatografică inversă poate se înceapă cu 5% metanol și să crească până la 50% în 25 minute; gradientul ales depinde de cât de hidrofob este analitul. Gradientul separă amestecul de analiți în funcție de afinitatea analitului pentru curentul fazei mobile raportat la faza staționară.