HPLC
De la Wikipedia, enciclopedia liberă
HPLC este prescurtarea de la High Performance Liquid Chromatography (Cromatografie lichidă de înaltă performanţă), metodă de analiză calitativă utilizată în biochimie şi chimie analitică pentru separarea, identificarea şi cuantificarea compuşilor. HPLC foloseşte o coloană încărcată cu diferite materiale (faza staţionară), o pompă ce împinge faza(ele) mobilă(e) prin coloana şi un detector care arată timpurile de retenţie ale moleculelor. Timpul de retenţie depinde de interacţiunea dintre faza staţionară, moleculele de analizat şi solvenţii utilizaţi.
Analiza
Proba de analizat este introdusă în volum mic în fluxul fazei mobile. Trecerea analitului prin coloană este încetinită de prezenţa unor interacţii de natură chimică sau fizică in faza staţionară, acestea trecând de a lungul coloanei. Totalul încetinirilor depinde de fiecare analit în parte, faza staţionară şi compoziţia fazei mobile. Timpul la care un analit specific eluează (iese afară din coloană) este numit timp de retenţie; timpul de retenţie sub condiţii particulare este considerat o caracteristică unică de identificare a analitului dat. Folosirea unei coloane încărcată cu particule mici (care creează o presiune de împingere mai mare) creşte viteza lineară, acordând compuşilor timpul minim să difuzeze prin coloană, conducând astfel la o îmbunătăţire a rezoluţiei cromatogramei rezultate. Solvenţii comuni care se utilizează includ orice combinaţie miscibilă cu apa sau lichide organice variate (de obicei metanol sau acetonitril). Apa poate conţine soluţii tampon sau săruri care ajută la separarea componenţilor de analizat sau componenţi ca acid trifloroacetic care acţionează ca agent de împerechere ionică.
O rafinare mai bună a metodei HPLC a dus la posibilitatea de a varia compoziţia fazei mobile în timpul analizei; aceasta este cunoscută sub denumirea de gradient de eluţie. Un gradient normal pentru o fază cromatografică inversă poate se înceapă cu 5% metanol şi să crească până la 50% în 25 minute; gradientul ales depinde de cât de hidrofob este analitul. Gradientul separă amestecul de analiţi în funcţie de afinitatea analitului pentru curentul fazei mobile raportat la faza staţionară.
